Objetivos de aprendizaje:

• Entender los principios básicos de la espectrofotometría.

• Conocer el fundamento detrás de la cuantificación de ADN a partir de la absorción de luz ultravioleta (UV).

• Interpretar los valores obtenidos para determinar la pureza y concentración del ADN.

Explica cómo el ADN absorbe luz en la región ultravioleta, particularmente a 260 nm, debido a los anillos aromáticos de las bases nitrogenadas.

Fundamento

La espectrofotometría es una técnica que mide la cantidad de luz absorbida por una muestra. Cada molécula absorbe luz a una longitud de onda específica.

Definición

Introducción a la espectrofotometría

Ley de Lambert-Beer

Donde:

• A es la absorbancia

• ε es el coeficiente de extinción molar*

• c es la concentración

• l es la longitud del camino óptico (generalmente 1 cm)

​Muestra cómo a partir de la absorbancia, se puede calcular la concentración de ADN en la muestra.

*​ El coeficiente de extinción molar (también llamado coeficiente de absorción molar) es una constante que describe cuán eficientemente una molécula absorbe luz a una longitud de onda específica. En términos más simples, mide la capacidad de una sustancia para absorber luz en función de su concentración.

Espectrofotometría aplicada al ADN

​Absorción del ADN a 260 nm:

Espectrofotometría aplicada al ADN

Pureza del ADN

Limitaciones y consideraciones

• ARN y contaminantes: El ARN también absorbe a 260 nm, por lo que podría afectar los resultados si no se eliminan completamente.

• Sustancias contaminantes: la presencia de contaminantes como fenol, sales o detergentes pueden interferir con las lecturas espectrofotométricas, reduciendo la precisión de la cuantificación.

• Alternativas para la cuantificación de ADN: Compara la espectrofotometría con otras técnicas como el uso de fluorometría (que usa tintes que se intercalan en el ADN para medir su concentración).