•Conocer los métodos de preparación en fresco y preparaciones fijas

•Preparar frotis fijos y tinciones simples.

•Identificar y describir las características morfológicas y la agrupación de las bacterias

•Conocer el fundamento, técnica y aplicación de las principales tinciones utilizadas en microbiología

•Identificar y describir el Gram de las bacterias presentes en muestras naturales

•Identificar y describir endoesporas y cápsulas en cultivos microbianos

• OBJETIVO

1. ​Se emplean para observar la movilidad, tamaño, forma de agrupación de los microorganismos en su estado natural Gránulos refráctiles, esporas y cloroplastos en células vivas

​La observación es difícil por la escasa diferencia entre los índices de refracción del medio y los microorganismos No hay buen contraste

Desventaja

PREPARACIÓN EN FRESCO O HUMEDAS

Utilidad

PROCEDIMIENTO

•Colocar con ayuda de una pipeta pasteur  1 gota de muestra  sobre un portaobjetos (limpio y desengrasado)

•Colocar el borde de un cubreobjetos sobre la gota en un ángulo de 45°

•Dejar caer el cubreobjetos gentilmente sobre la gota de muestra

•Observar al microscopio a 10x y 45x

No iluminar en exceso, baja intensidad de luz

​Permite observar microorganismos sin movimientos.
La tinción mejora considerablemente el contraste.
Se realiza un frotis por distribución de la muestra con agua, con cinta adhesiva trasparente o con hisopo

​

Preparaciones fijas y teñidas

​Recomendaciones

• Un microorganismo Gram positivo debe presentar una pared celular sana, si sufre daño de la pared se vuelve Gram negativo.
• La cepa a observar debe ser de 24 horas
• Tomar cantidad adecuada de muestra
• Manipulación cuidadosa al esparcir
• Elegir colorantes adecuados al componente celular a teñir
• Verificación control calidad colorantes (teñir cepas típicas juntas Gram (+) Gram (-)

​Hans Christian Gram

Bacteriólogo danés

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TINCIONES DIFERENCIALES
Tinción de Gram

•Desarrollada en 1884 por Hans Christian Gram

•Clasificación bacteriana: Gram(+) y Gram (-)

•Se basa en las características de la pared celular de las bacterias

•Consiste en los siguiente pasos:

•1. Tinción primaria. Tinción con cristal violeta por 1 minuto (colorante primario). Toda célula es teñida

•2. Agente mordente (lugol/yodo-yoduro) . Se une al cristal violeta en la celula y forma un complejo de cristal violeta-yoduro (CV-I)-ribonucleato de magnesio 1 minuto

•3. Agente decolorante (etanol-acetona) Lava el colorante primario de aquellas bacterias que son incapaces de retener el colorante primario disolviendo lípidos de membrana externa. La pared de bacterias Gram (+) se deshidrata y cierra poros. 30 segundos

•4. Tinción secundaria o de contraste con safranina 1 minuto. Se tiñen las bacterias decoloradas (Gram negativas (-))

•*Enjuagar con agua en cada paso.

•Resultado:

–Bacterias moradas= Gram positivas (+)

–Bacterias rojas= Gram negativas (-)

Visualiza el siguiente video

https://www.youtube.com/watch?v=znoqqYJwRTc

Realiza tu lista de materiales en base al video anterior

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